Som du påpeger, fungerer BLAST ikke godt til læsninger fra et typisk RNASeq-eksperiment.

Fra et RNASeq-datasæt kan du muligvis slippe væk med bare en ribosomal skærm ved hjælp af Silva, fordi ribosomet er det mest rigeligt transkriberede gen. Dette vil normalt være tilfældet, selvom polyA-selektion eller ribosomal udtømning blev udført på en prøve.

Husk dog, at der vil være mange falske resultater på grund af database-ufuldstændighed. Jeg brugte Kraken, da jeg gjorde noget lignende for et par år siden, og endte med en sekvens, der blev kommenteret som en frugtflagermus (hvor mit emne var en vandlevende planarisk fladorm). Centrifuge ville være en bedre mulighed nu; forfatterne hævder endda, at de kan gemme hele nr i et 70 GB indeks med Centrifuge (hvilket ville være bedre / mere omfattende end bare en ribosomal skærm).

Jeg tror, ​​du bare leder efter nr . Det er absolut ikke begrænset til prokaryoter, langt fra det. Ifølge blurb på NCBI's eksplosionsside:

Nukleotidsamlingen består af GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + RefSeq-sekvenser, men ekskluderer EST, STS, GSS, WGS, TSA , patentsekvenser såvel som fase 0, 1 og 2 HTGS sekvenser. Databasen er ikke overflødig. Identiske sekvenser er blevet flettet i en post, samtidig med at oplysningerne om tiltrædelse, GI, titel og taksonomi bevares for hver post.

Det link, du gav i dit spørgsmål, beskriver ikke nr database, men samlingen af ​​RefSeq ikke-redundante sekvenser. De to er slet ikke den samme. Nr-databaser indeholder sekvenser fra alle tilgængelige arter, så det skal være perfekt til det, du leder efter.

Nu indrømmer jeg, at jeg ikke har prøvet dette med millioner af redas, men jeg kørte mange eksplosionssøgninger med flere tusinde sekvenser ved hjælp af kommandolinjens eksplosionsværktøjer og den eksterne nr-database. Jeg har lige tjekket blast + docs nu og ser ingen omtale af en satsgrænse. Hvilket ikke er at sige, at der ikke er en bestemt, men da hver forespørgsel køres sekventielt, når du giver en multifasta-fil, ser det ud til at være grund til at begrænse, da serverne skal være i stand til at stille jobene i kø efter behov.

Så brug ikke API'en eller rul din egen, bare download NCBIs blastklient og prøv det:

  blastn -query query .fa -db nr -opgave blastn 

Hvis det klager, bliver du nødt til at downloade nr DB (godt, da du vil have nukleotidblast, har du sandsynligvis vil have sin nukleotidfætter, nt ), som du kan finde her: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/. Hent bare alle foo.nt * filer.

Det kan være en god idé at undersøge minihashes som en mere effektiv måde at gruppere og sammenligne dine sekvenser med kendte arter og prøver. I mosepapiret viser forfatterne, hvordan det ville være muligt at oprette minihash-skitser, som du kunne søge mod fra store metagenomiske datasæt (se afsnittet "Clustering massive metagenomic datasets" i resultaterne):

Til en storstilet test blev prøver fra Human Microbiome Project [36] (HMP) og Metagenomics of the Human Intestinal Tract [37] (MetaHIT) kombineret for at skabe en ~ 10 TB 888-prøve datasæt. Det er vigtigt, at størrelsen på en Mash-skitse er uafhængig af inputstørrelsen, hvilket kun kræver 70 MB for at gemme de kombinerede skitser (s = 10.000, k = 21) til disse datasæt.

Desuden skaberne af sourmash (et værktøj, der bruger samme tilgang) leverer forudberegnede skitser til hele NCBI's RefSeq-database (inkluderer bakterie-, viral- og svampegenomer). Oprettelse af en lignende skitse for hele ENA / SRA (eller en delmængde af den) kan tage lidt tid, men muliggøre meget hurtige og nøjagtige søgninger.

En ting, der hidtil ikke er blevet foreslået, er fylogenetisk placering. Den første mulighed ville være at placere mod et større træ, der groft rører ved de domæner, du nævnte, for at få et overblik. Den anden mulighed ville være at have tre træer (bakterier, planter, vira), der består af relevante taxa for den type prøve, du har.

Dette giver dig en detaljeret og nøjagtig oversigt over din prøve, men det gør involvere noget arbejde. Desværre er beregningsgennemstrømningen til placering stadig lidt bag BLAST, og der findes ikke mange komplette rørledninger, men efter min mening er det en ekstra mil værd (jeg kan være partisk. Jeg arbejder på at løse så mange af disse problemer som muligt) .

Hvis du vil undersøge det, kan jeg anbefale dette fremragende papir af Erick Matsen. Da dine prøver lyder vagt jordisk, vil jeg også linke dette nylige naturpapir ved hjælp af placering til at analysere jordprøver i regnskov.

Jeg har haft god succes ved at bruge MEGAN-softwaren til at opdage og visualisere forurening. Mine inputdata var WGS ikke RNA-seq Men jeg ville tjekke det ud. Det kan skabe et meget flot fylogenetisk træ til alle de påviste organismer.

https://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6